• 著名画家傅狷夫艺术特展将于中国美术馆开幕 不要轻易放弃。学习成长的路上,我们长路漫漫,只因学无止境。


    本实验主要通过合成生物表面活性剂鼠李糖脂,并将其加入校园含油污水中研究其对污水降解的增效作用。【关键词】生物表面活性剂;鼠李糖脂;污水;修复1、前言随着人们的生活水平不断的提高,餐饮业在各个城市也迅速发展,餐饮废水的排放量逐渐增大,由此而产生的含油脂污水特别是含高浓度油脂的污水量大幅度增长,已成为城市生活污水的重要组成部分。油类物质进入水体,则漂浮于水体的表面,影响水体的复氧及其自然净化过程,危害水体生态系统,又会引起水体的富营养化,威胁环境和人类健康。目前处理餐饮废水的方法主要有物理法、化学法和生物法三种方法。与物理、化学法相比,微生物处理法具有经济、高效的优点,并可以实现无害化、资源化,所以生物法在污水处理中长期以来占重要位置。生物表面活性剂在污水的修复中有明显的增效作用。和化学合成的表面活性剂先比具有以下优越性:①生物表面活性剂具有一般化学合成的表面活性剂所不具有的独特的化学结构,从而产生一些对修复有用的性质。②生物表面活性剂是由微生物代谢产生的可生物降解的物质。投放到被污染地区不会造成新的污染。③与化学合成的生物表面活性剂相比,生物表面活性剂的生产价格是可以接受的。④生物表面活性剂可以在污染地区及其附近生产得到,不需要运输和储存。本实验主要通过合成生物表面活性剂鼠李糖脂,并将其加入校园含油污水中研究其对污水降解的增效作用。2.实验部分2.1实验材料与方法2.1.1实验材料(1)实验土样:石油污染土样取自油田油井附近地表深度为10cm左右的石油污染土壤。(2)种子培养基斜面培养基(g/L):牛肉膏2.0,蛋白胨5.0,NaCl5.0,琼脂20.0,pH值7.0。(3)种子培养基(g/L):牛肉膏3.0,蛋白胨5.0,NaCl5.0,pH值7.0。(4)发酵培养基(g/L):豆油50,NaNO3 8.0,KH2PO4 1.0,Na2HPO4・12H2O 1.0 ,FeSO4・7H2O 0.2,PH值为7.0。(5)苯酚溶液的配制:取5ml苯酚溶液放入到100ml容量瓶中,稀释到刻度,得5%的苯酚溶液,将其置于冰箱中备用。(6)鼠李糖标准溶液的配制:准确称取一定量鼠李糖溶于100ml容量瓶中,然后再配成不同浓度的标准溶液。2.2实验仪器及试剂2.2.1主要设备超净工作台 JJT7A全自动高压灭菌锅 HVE50震荡培养箱 QHZ98A高速台式冷冻离心机 HFsafe1200电子分析天平 BP211D型2.2.2实验试剂及仪器无机盐培养基(BR,上海化学试剂公司)、氯仿(AR,上海化学试剂公司),经重蒸后使用。甲醇(AR,上海化学试剂公司)、苯酚(分析纯重蒸馏试剂)、标准鼠李糖(国药)、氢氧化钠(分析纯)、盐酸(分析纯)、浓硫酸(分析纯)、去离子水、蒸馏水、分液漏斗、抽滤瓶、圆底烧瓶、直形冷凝管、蒸馏头、锥形瓶、烧杯、量筒、玻璃棒、移液管、吸耳球、药勺、胶头滴管、容量瓶、移液枪、称量瓶。2.3实验步骤2.3.1产表面活性剂菌的分离纯化取土样2.5g,加200mL无机培盐养基,在30℃,120r/min 的恒温摇床上振荡培养7d,移取一定量的富集培养液接入新鲜含油无机盐培养基中,同样条件下培养7d,共重复3次,在无菌的条件下,用接种环蘸取驯化培养液,在分离培养基的平板上划线后,平板倒置于恒温培养箱中培养24h,然后将典型菌落在分离培养基的平板上反复划线纯化后得到单一菌落,再将纯化的菌株接种至斜面培养基上培养后,4℃保存于冰箱中。2.3.2鼠李糖脂的发酵培养及提取配置发酵培养基,高压灭菌后将A6 4%接入发酵培养72h,取发酵液在8000r/min,4℃下离心20min取出上清液,加6mol/L的HCL调节PH值至2.0,静置过夜。用等体积氯仿/甲醇=2/1萃取,取下层有机相,64℃减压蒸馏得到浅黄色浆状物,既为表面活性剂的粗产物。2.3.3鼠李糖脂的含量测定将鼠李糖脂粗产物稀释至0~80mg/l的范围内,用同样的方法在480nm下测吸光度。根据标准曲线计算鼠李糖脂的浓度。得到的鼠李糖脂的浓度(CRH)和鼠李糖浓度(CR)的倍比关系CRH=3.5CR,计算鼠李糖脂的浓度。2.3.4鼠李糖脂产生条件的优化分别以葡萄糖、原油、甘油、豆油为唯一碳源,以NaNO3为氮源发酵培养,考察不同碳源条件下生物表面活性剂鼠李糖脂的产量情况。用同样的方法研究以尿素,NH4Cl,(NH4)2SO4,NaNO3为唯一氮源,豆油为碳源时,生物表面活性剂鼠李糖脂的产量情况。确定最优碳源和氮源。2.3.5鼠李糖脂在污水修复中的应用(1)污水中油脂含量的测定取50ml混合均匀的水样,加入等体积的氯仿萃取,取出氯仿相。减压蒸馏,将其中的氯仿蒸出。准确称量称量瓶的重量,并将蒸馏后剩余的油脂用少量的氯仿溶解转入称量瓶中,放入水浴锅中将其氯仿蒸发殆尽(多次称量直至重量恒重),再准确称量称量瓶和油脂的总重量,减量法得出称量瓶中油脂的重量。(2)鼠李糖脂在污水修复中的作用取三组混合均匀的水样各1L,给其中一组加900mg/l的鼠李糖脂,另一组加入同样量的鼠李糖脂和降油菌,另一组做空白对照,分别测第5、10、15天时废水中油脂的含量,观察其变化情况3.实验结果与讨论  3.1产表面活性剂菌株的分离和筛选从油田油井附近所取的土壤样品中,经过平板分离筛选纯化,得石油降解菌A6。A6菌为铜绿假单细胞菌, A6菌株形态特征和生理生化试验指标等实验结果与假单胞菌属的基本特征一致,所以以A6菌为实验所用的菌。3.2鼠李糖脂的发酵培养及提取在发酵生产的鼠李糖脂过程中,发酵液在培养的第二天就发生了明显的乳化现象,表明以豆油为碳源能够诱导试验菌种产生鼠李糖脂,从而促进菌种对豆油的摄入和利用。萃取过程中,出现界面明显的分层,上层呈浅绿色,中层乳白絮状混浊乳化层,下层为透明至白色有机溶液,取下层萃取液于旋转蒸发仪中,减压蒸馏得到棕黄色鼠李糖脂粗品。3.3鼠李糖脂的含量测定(1)鼠李糖标准曲线的绘制用紫外分光光度法在480nm处测得鼠李糖的标准曲线(见图1.1)的标准方程y=0.172x+0.0188――①,相关系数为0.9992,可见样品中鼠李糖的浓度和吸光度之间的关系可以很好的用①式表示。①式中:y――鼠李糖溶液的吸光度。x――鼠李糖的浓度,单位mg/l。(2)鼠李糖的含量测定测得样品的吸光度为1.501,将测得的吸光度值代入方程y=0.172x+0.0188中,得x=86.17,样品中鼠李糖的浓度为86.17mg/l。根据鼠李糖脂的浓度(CRH)和鼠李糖的浓度(CR)的倍比关系CRH=3.5CR,计算出样品种鼠李糖脂的含量为30.17%。3.4鼠李糖脂产生条件的优化(1)碳源优化分别选用葡萄糖、原油、甘油、豆油为唯一碳源,NaNO3为氮源,发酵培养,所产生鼠李糖粗产物的干重如下图:由图可以看出,甘油为碳源时产生的鼠李糖脂的量最多,而以豆油为碳源时产生的鼠李糖的量仅次于甘油为碳源时产生的鼠李糖脂量。不同碳源产生树立糖脂的量不同,碳源是构成细胞物质和供给微生物生长发育所需要的能量,为细胞代谢产物中碳源开来源提供营养物质,不同为生物对碳源的利用情况有差异,但大部分微生物以有机碳化合物为碳源和能源。碳源的分析结果显示,甘油为碳源是鼠李糖脂的产量最为理想,甘油发酵中细胞生长和产物合成具有相同的代谢途径,所以鼠李糖脂的产量高。但是由于甘油成本较高,从经济方面考虑,豆油是大规模生产鼠李糖脂的首选碳源。(2)氮源的优化分别以尿素,NH4Cl,(NH4)2SO4,NaNO3为唯一氮源,豆油为碳源,在相同培养条件下发酵培养,测得鼠李糖脂粗产物的干重如下图:由上图可以看出,以NaNO3为氮源时所产生的鼠李糖脂最多。氮源是合成生物表面活性剂鼠李糖脂的关键,它提供了合成原生质和细胞其它结构的原料,对微生物的生长发育和稳定生长及细胞产生生物表面活性剂其重要作用。NaNO3在鼠李糖脂的合成中具有促进作用,NaNO3为合成鼠李糖脂最佳氮源。3.5鼠李糖脂和降油菌联合植物对污水的修复(1)污水中油脂的含量恒重法测得50ml混合均匀的水样中油脂的含量为0.0227g,经计算得出餐厅污水中油脂的含量为0.454g/l。(2)鼠李糖脂在修复中的作用分别测得鼠李糖脂及鼠李糖脂加降油菌对污水中油脂降解效果由上图可以看出,三组污水中油脂都降低了,并且降解时间越长降解率随之增高。空白组中油脂的含量都有所降低。加入900mg/l的鼠李糖脂后油脂的含量和COD值有明显的降低,降解率约增加10%,污水在鼠李糖脂和降油菌共同作用下降解效果最好。污水有一定的自净能力,水中的有机污染物在微生物的作用下进行氧化降解,逐渐被分解,最后变为无机物,是污水中有机污染物浓度降低。在污水中加入生物表面活性剂后,污水的降解率有明显的增高,原因是鼠李糖脂可以增强污水中疏水化合物的生物可利用性和生物降解作用,主要通过增加疏水的不溶性基质的表面积和增加疏水化合物的生物利用率来对污水进行修复。其次,鼠李糖脂的乳化作用可以使油脂液滴在水相中分散,并且增加两相之间的界面面积,能增强憎水性物质的亲水性和生物可利用性,降低其表面张力,降解率增加。鼠李糖脂还可以增加细胞壁的疏水性,使油脂进入细胞内从而被酶代谢,油脂在水中溶解度极低,鼠李糖脂可以促进疏水化合物的分散,增强疏水化合物的利用率。微生物是污水修复的主体,主要通过分泌胞外酶对有机污染物降解和吸收到细胞内由胞内酶对有机污染物降解,在污水中加入降油菌后,污水中微生物的种类和数量都有所增加,有机污染物会其被充分利用,降解率增高。4、结论本实验主要研究了生物表面活性剂鼠李糖脂的发酵产生及提取方法,并对其产生条件进行了优化,最后将其加入餐厅污水中研究在餐厅污水降解中的作用。实验得出的主要结论有:①可用发酵法发酵产生鼠李糖脂并用萃取法可将鼠李糖脂从发酵液中提出,减压整蒸馏后可得到黄色胶状物鼠李糖脂。②碳、氮源的优化结果表明,产生生物表面活性剂的首选培养基为(g/L):豆油50,NaNO3 8.0,KH2PO4 1.0,Na2HPO4・12H2O 1.0 ,FeSO4・7H2O 0.2,PH值为7.0。③生物表活性剂主要通过增加疏水的不溶性基质的表面积和增加疏水化合物的生物利用率来对含油进行修复。其次,鼠李糖脂的乳化作用可以使油脂液滴在水相中分散,并且增加两相之间的界面面积,能增强憎水性物质的亲水性和生物可利用性,降低其表面张力,降解率增加。鼠李糖脂还可以增加细胞壁的疏水性,使油脂进入细胞内从而被酶代谢,油脂在水中溶解度极低,鼠李糖脂可以促进疏水化合物的分散,增强疏水化合物的利用率。【参考文献】[1]张天胜等.生物表面活性剂及其应用[M].北京:化学工业出版社,2005:267294。[2]方云.生物表面活性剂[M].北京:中国轻工业出版社,1992:2122.[3]沈德忠.污染环境的生物修复[M].北京:化工工业出版社,2002:381385.[4]梁生康.鼠李糖脂生物表面活性剂对石油烃污染物生物降解影响的研究[D].中国海洋大学,2005.[5]吴小红.鼠李糖脂在石油废水处理中的应用研究[D].湖南大学,2006.[6]吴星杰.生物表面活性剂鼠李糖脂的制备及其对PCBs污染土壤的修复[D].湖南大学,2007.

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